摘要：脑震宁颗粒为经典的中药复方制剂，具有凉血活血、化瘀通络、益血安神、宁心定智、除烦止呕等功效，现代临床常用于治疗脑外伤引起的头痛、头晕、烦躁失眠、健忘、恶心呕吐等。通过梳理现代研究文献，基于中药质量标志物（Q-marker）“五原则”对脑震宁颗粒的Q-marker进行预测分析，进一步对已选定的Q-marker进行现代药理文献综述，构建“Q-marker-靶点-通路-疾病”的网络关联图，以期为脑震宁颗粒的质量控制研究提供参考。
中药质量是对中药有效性和安全性的反映和表征，而质量控制和评价是中药现代化发展的关键科学问题[1-2]。但现行质量标准仍存在诸多问题，难以客观评价和有效控制中药质量[3]，针对这个问题，刘昌孝院士在研究现有质量评价与控制方法及存在的问题上，提出中药质量标志物（Q-marker）的新概念[4]，而中药的有效性及安全性在临床上主要是通过方剂表达，只有在方剂配伍的环境下，筛选出能够发挥疗效的显效成分，由此建立的质量标准才具有临床的有效性和安全性。在此基础上有学者提出复方中药Q-marker的“五原则”研究路径，目前已经应用于疏风解毒胶囊、桂枝茯苓胶囊等复方中药制剂Q-marker的预测分析[5-6]。
脑震宁颗粒（NaozhenningGranule，NG）是一种纯中药复方制剂，由当归、地黄、牡丹皮、川芎、地龙、丹参、茯苓、陈皮、酸枣仁、竹茹、柏子仁11味药材组成。其中以当归养血和血为君药；以生地黄、牡丹皮凉血散瘀，丹参、川芎活血化瘀共为臣药；以地龙清热活络、利尿止痉，竹茹清热涤痰、解郁止呕，陈皮理气化痰、健脾燥湿，茯苓健脾利湿、宁心安神，柏子仁、酸枣仁养心安神共为佐使药[7]。临床上用于治疗颅脑损伤后遗症、血管神经性头痛、改善轻中型颅脑外伤症状、促进功能恢复和纠正神经功能紊乱等疾病[8]。
NG组方复杂，目前现有的质量控制主要集中于有效成分的测定。卫生部颁布标准中对其阿魏酸和原儿茶醛进行了薄层色谱鉴别；李献玉等[9]采用HPLC法同时测定NG中丹酚酸B和橙皮苷的含量，结果两者在线性范围内均有良好的线性关系，精密度分别为1.26%、1.08%，符合精密度要求，方法简便、精密度高、可靠性强、操作简便，可用于NG的质量控制；李军等[10]采用HPLC法测定NG中阿魏酸和橙皮苷的含量，结果两者在线性范围内均有良好的线性关系，精密度与重复性RSD均小于1.5%，方法灵敏、重复性高、样品处理简单，可用于NG的质量控制。尽管对NG中有效成分的测定能够为其质量控制提供依据，但是复方中药药效发挥是由多个有效成分共同作用的结果，仅对任何单一成分进行质量控制还无法达到质量控制的全面性和准确性的目的，基于Q-marker的检测分析已经成为中药质量控制的发展方向[11-12]。因此，需要将NG中的有效成分进行多维度的分析，进而找到能够从整体上表征其质量的Q-marker，从而建立以Q-marker为核心的质控指标，用于NG的质量控制[13]。
本文主要依据“五原则”对NG的Q-marker进行预测分析，并结合网络药理学对筛选出的Q-marker进行“Q-marker-靶点-通路-疾病”的网络构建，以期为NG的质量控制研究提供依据。
1Q-marker的预测
1.1基于质量“传递”和“溯源”的Q-marker的辨识
1.1.1原料药材中化学物质的辨识通过液相质谱法对NG组方药材中含有的成分进行表征和辨识，从11味原料药材中共辨识出个化合物。其中Wu等[14]从当归药材中辨识出24个化合物，包括11个酚类成分、12个苯酞类成分和1个氨基酸成分；赵文军等[15]从牡丹皮药材中辨识出48个化合物，包括11个没食子酸类成分、17个单萜及其苷类成分、8个酚酸类成分、1个三萜类成分、7个苯乙酮类成分和4个黄酮类成分；高昕等[16]从川芎药材中辨识出30个化合物，包括20个苯酞类成分、2个黄酮类成分、1个生物碱成分和7个酚酸类成分；张玉等[17]从地龙药材中辨识出84个化合物，包括11个游离的氨基酸成分、26个有机酸类成分、11个核苷类成分、5个二肽及环二肽类成分、21个含氮类成分和10个其他类成分；张弛等[18]从丹参药材中辨识出70个化合物，包括50个二萜类成分和20个酚酸类成分；康安等[19]从茯苓药材中辨识出42个化合物，包括35个三萜类成分和7个其他类成分；张波泳等[20]从地黄药材中辨识出26个化合物，包括12个环烯醚萜苷类成分、8个苯乙醇苷类成分、3个核苷类成分、2个有机酸类成分和1个紫罗兰酮；马琳等[21]从陈皮药材中辨识出32个化合物；从柏子仁药材中辨识出49个化合物[22-23]；从酸枣仁药材中辨识出个化合物，包括20个达玛烷型三萜皂苷类成分、14个五环三萜类成分、34个黄酮类成分、18个生物碱类成分、41个脂肪酸类成分和4个酚类成分[24-27]；从竹茹药材的乙醇提取物中辨识出14个化合物，包括1个三萜类成分、6个甾体类成分、1个黄酮类成分、1个木脂素类成分和5个其他类成分[28-29]。
1.1.2制剂中原型成分的基础表征和辨识研究采用UHPLC-QExactive轨道肼高分辨质谱的方法[30]，对NG中的化学成分进行表征和辨识，从NG中共辨识出个化合物，包括26个黄酮及黄酮苷类成分、9个环烯醚萜苷类成分、9个生物碱类成分、8个丁基苯酞类成分、8个酚酸类成分、8个单萜苷类成分，以及有机酸、糖类、氨基酸等中药材共有成分。对所辨识的化合物进行归属，其中64个来源于酸枣仁、62个来源于陈皮、58个来源于川芎、54个来源于当归、50个来源于丹参、49个来源于牡丹皮、42个来源于地黄、36个来源于竹茹、37个来源于柏子仁、32个来源于地龙、28个来源于茯苓。上述归属包括多种药材中的共有成分，如糖类、氨基酸类以及小分子的有机酸类。
1.1.3入血成分及其代谢产物的辨识采用UHPLC-QExactive轨道肼高分辨质谱的方法，优化色谱、质谱分离检测，快速地分析和鉴定了通过口服给予NG后大鼠的血清中的吸收原型成分及其代谢产物[27]。口服给予NG后大鼠血清中共鉴定出60个与NG相关的外源性化学成分，其中包括30个原型成分和30个代谢产物，分别为5个环烯醚萜类成分、11个丁基苯酞类成分、4个丹酚酸类成分、4个黄酮苷类成分、2个酸枣仁皂苷类成分、4个生物碱类成分、3个咖啡酰奎尼酸类成分和27个其他类成分。进一步归属可知，7个化合物来源于所有药材、17个化合物来源于当归、9个化合物来源于地黄、9个化合物来源于丹参、9个化合物来源于陈皮、1个化合物来源于地龙、12个化合物来源于牡丹皮、18个化合物来源于酸枣仁、18个化合物来源于川芎、1个化合物来源于竹茹、1个化合物来源于柏子仁、1个化合物来源于茯苓。
1.1.4NG药材原有成分-制剂原型成分-血中效应成分的传递和变化通过对药材、制剂与血中移行成分的整体辨识，进一步将其制剂中的成分和入血后的效应成分进行对比归属，阐明了质量“传递”和“溯源”的过程（表1），明确其变化规律（图1）。现代研究表明在血清中能够检测到的原型成分和代谢产物，可能为复方制剂潜在的真正的活性成分，并与NG的药理活性直接相关，应作为Q-marker的重要选择[5]。
1.2基于成分特有性对NGQ-marker的辨识
在NG中当归为君药，地黄、牡丹皮、丹参、川芎为辅药，陈皮、酸枣仁为佐使药。而以上7味药材也是NG入血成分的主要来源，故对其成分的特有性进行分析，进而选定各单味药中的特有成分作为NGQ-marker确定的重要依据和可行路径。
1.2.1当归、川芎成分的特有性当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diels的干燥根，川芎为伞形科植物川芎LigusticumchuanxiongHort.的
干燥根茎。根据文献分析和本课题组的研究表明，二者同属一科，有相似的化学成分和药理作用，主要含有挥发油类、有机酸类、多糖类和黄酮类等成分。二者均以苯酞类为主的挥发油类成分为主要活性成分，具有多种药理作用[31]，可作为二者在NG中区别于其他药材的特征成分。
1.2.2地黄成分的特有性地黄为玄参科植物地黄RehmanniaglutinosaLibosch.的新鲜或干燥块根，根据文献分析和本课题组的研究表明，地黄中主要含有环烯醚萜苷类、多糖类、氨基酸类和其他类等成分，其中以梓醇、地黄苷A/D/E等为主的环烯醚萜苷类为地黄中的特征成分，药理作用广泛，主要表现在对免疫系统、中枢神经系统、血液系统等方面[32]。
1.2.3牡丹皮成分的特有性牡丹皮为毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的干燥根皮，根据文献分析和本课题组的研究表明，牡丹皮中主要含有三萜及其苷类、单萜及其苷类、酚及酚苷类和其他类等成分，其中以丹皮酚为主的酚及酚苷类成分和以芍药苷为主的单萜及其苷类为牡丹皮的特征成分，含量高，同时具有调节免疫、抑制中枢反应、镇痛等作用[6]。
1.2.4丹参成分的特有性丹参为唇形科植物丹参SalviamiltiorrhizaBge.的干燥根和根茎，根据文献分析和本课题组的研究表明，丹参中主要含有二萜类、酚酸类、挥发油类、无机元素类和其他类等成分，其中以丹参酮类为主的二萜类成分和以丹酚酸为主的酚酸类成分为丹参的特征成分，药理作用主要表现在保护心脑血管系统、抗肿瘤、抗菌、抗炎、保护器官等方面[33]。
1.2.5陈皮成分的特有性陈皮为芸香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培变种的干燥成熟果皮，根据文献分析和本课题组的研究表明陈皮中主要含有黄酮类、挥发油类、三萜类、微量元素类和其他类等成分，其中以橙皮苷、柚皮苷等为主的黄酮类化合物为陈皮的特征成分，药理作用主要表现在清除自由基、抗氧化、调节心血管系统等方面[34]。
1.2.6酸枣仁成分的特有性酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZiziphusjujubaMill.var.spinosa(Bunge)HuexH.F.Chou的干燥成熟种子，根据文献分析和本课题组的研究表明，酸枣仁中主要含有皂苷类、黄酮类、三萜类、生物碱类、脂肪油类和其他类等成分，其中以酸枣仁皂苷为主的皂苷类、斯皮诺素等为主的黄酮类和以木兰花碱为主的生物碱类为酸枣仁的特征成分，含量高，对中枢神经系统特别是镇静催眠、抗惊厥、抗焦虑、抗抑郁等具有一定的作用[24,35]。
1.3基于“性（味）”物质基础的界定对Q-marker的研究
中药的药性理论体系是中医药学理论体系中的重要组成部分，而中药药性主要包括归经、升降浮沉、四气、五味、十八反和十九畏等理论，其中四气、五味和归经为中药药性理论的纲领部分[36]。临床上主要以遣药组方为主，但是中药药性具有多样性和复杂性，故表现出“效同性异”“性同效异”和“效性相同”等特点，在临床应用时应注意药性理论具有主次之分，何者在方剂中起主导作用，其对应的功效就会更突出地体现这方面的特性[37]，因此也应作为Q-marker确定的依据之一。结合上述对入血成分和方剂君臣佐使原则的分析，总结NG中7味药材（当归、川芎、地黄、牡丹皮、酸枣仁、丹参、陈皮）的药性、归经、功效、主治和主要物质基础（表2）。
1.4基于网络药理学对NG复方配伍的Q-marker研究[27,43]
基于NG入血成分研究结果，并结合相关文献报道，按照图2标示的路径对相关数据分析最终筛选出主要的有效成分。以40个入血原型成分和代谢物进行靶点、通路进行预测，研究结果发现选定的40个成分均能够作用于与脑外伤、脑震荡和神经保护等疾病相关的靶点及18条通路，主要通过调控氧化应激、降低炎症因子水平缓解脑外伤后引发的炎症反应、调节脑内硫化氢生成改善认知功能及脑外伤后抑郁、抑制细胞凋亡等，体现了NG治疗脑外伤的多成分多靶点多通路的作用机制。研究结果提示，NG处方配伍中有效成分可能为芍药苷、隐丹参酮、丹参酮IIA和丹参酮I、酸枣仁皂苷A、Z-藁本内酯、梓醇、茯苓酸B、川芎内酯A、川芎内酯H/I等。
1.5基于成分可测性对NGQ-marker的辨识分析
从Q-marker应用的角度，“成分的可测性”又是确定Q-marker的重要依据。文献研究表明，目前对于中药化学成分的分析和测定主要是通过色谱手段，NG的Q-marker需要能够在色谱条件下进行定性、定量的测定，力求科学地指导质量控制和质量评价[5,44-45]。故应聚焦于既有专属性又具有活性，且能够通过简单的前处理方式便于用色谱方法测定的成分，将其作为Q-marker。
根据以上分析可知，以藁本内酯、川芎内酯为代表的苯酞类成分，以梓醇、地黄苷为代表的环烯醚萜类成分，以丹皮酚、丹酚酸为代表的酚及酚酸类成分，以丹参酮为代表的二萜类成分，以斯皮诺素、橙皮苷、芍药苷为代表的黄酮类成分，以酸枣仁皂苷为代表的皂苷类成分和以木兰花碱为代表的生物碱类为NGQ-marker的重要选择。采用HPLC可以同时测定NG中丹酚酸B、橙皮苷和阿魏酸的含量[9-10]；《中国药典》年版规定了梓醇、丹皮酚、丹参酮类、丹酚酸、橙皮苷、酸枣仁皂苷和斯皮诺素的测定方法和限度要求；李更生等[46]采用HPLC法测定地黄中地黄苷D的含量；李盈等[47]采用HPLC法测定牡丹皮中芍药苷的含量；李冰洁等[48]采用HPLC-DAD法同时测定酸枣仁中木兰花碱和斯皮诺素的含量。
根据Q-marker的定义和复方中药的“五原则”路径，找到存在于NG中与其临床疗效密切相关的化学物质，初步选定藁本内酯、川芎内酯、梓醇、地黄苷、丹皮酚、丹酚酸、丹参酮、斯皮诺素、芍药苷、橙皮苷、酸枣仁皂苷、木兰花碱这12个化合物作为NG的Q-marker。
2Q-markers的现代药理研究
现代药理研究表明，酸枣仁中的皂苷类成分酸枣仁皂苷、酸枣仁总黄酮类成分和总生物碱均对中枢神经系统有一定作用，包括镇静催眠作用[49-50]、抗惊厥[51]、抗焦虑[52]、抗抑郁[53]、抗应激性溃疡[54]、改善学习记忆能力等作用[55-56]；丹参中的酚酸类成分丹酚酸B和二萜类成分丹参酮具有抗炎作用，丹参酮IIA能够有效降低放射性脑损伤小鼠的脑细胞凋亡，减轻对脑细胞的损伤，改善脑损伤小鼠的学习记忆功能，丹酚酸B可以保护脑组织、脑内神经细胞、缓解缺血引起的脑水肿进而改善脑内微循环[57-58]；牡丹皮中的酚酸类成分丹皮酚和单萜苷类成分芍药苷具有抗肿瘤、抗菌消炎、抗氧化、调节免疫功能等作用[59-60]；陈皮中的黄酮类成分橙皮苷具有一定的保肝[61]、抗炎镇痛[62]、清除自由基、抗氧化、免疫调节等作用[63]；地黄中的环烯醚萜苷类成分梓醇对神经系统有一定的作用，包括在脑缺血损伤、老年痴呆症、帕金森病和衰老神经疾病中的作用，其作用机制可能为抗氧化作用、抗炎作用和提高神经可塑性，此外研究发现梓醇对于神经性疼痛有明显的抑制作用，可以显著减少抑郁症模型大鼠的血清皮质醇水平，表现出一定的抗抑郁作用，并且能够提高认知记忆的能力[64]，地黄苷A则具有较好的免疫活性[65]；苯酞类成分藁本内酯是当归和川芎中共有的活性成分，具有镇痛、抗炎的作用，通过增加内源性抗氧化防御能力来发挥对老年痴呆的治疗作用，通过减少氧化应激反应和抗凋亡作用对脑缺血再灌注模型小鼠发挥神经保护作用，改善小鼠认知功能[66]；川芎中的苯酞类成分川芎内酯A对于体外培养的乳鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤具有保护作用，抑制环氧合酶-2（COX-2）的表达，表现出一定的抗炎镇痛作用，具有抗血小板聚集和抗凝作用[67]。
3NG的“Q-marker-靶点-通路-疾病”网络构建
3.1Q-marker靶点预测结果分析
将Q-marker成分输入DRAR-CPI得到所对应的chemical-protein打分值，以Z-score＜?1为阈值筛选后共得到个靶点的PDBID。在Uniprot网站输入这些靶点的PDBID，共得到个靶点。
3.2Q-marker疾病富集及潜在作用信号通路分析
运用CooLGeN数据库搜索文献报道中与脑震荡、脑外伤、神经保护、神经再生的相关的靶点，与上述个靶点进行对比分析，得到15个可能与NG治疗脑外伤相关的潜在作用靶点。将筛选得到的上述潜在靶点导入DAVID数据库，输入靶点名称列表限定物种为人，经数据库检索、转化，设定阈值P＜0.05，进行KEGG代谢通路富集分析，将潜在的作用靶点直接映射到通路上，药物成分靶点富集的通路被认为是药物调控的通路。对作用靶点进行关联分析，Q-markers在诸多脑部疾病的相关通路上发挥着重要的作用，共富集通路12条，如mTOR信号通路、MAPK信号通路、TNF信号通路等。用GraphPadPrism5绘图，得到Q-markers潜在活性靶点的KEGG代谢通路图（图3）。
3.3Q-marker-靶点-通路-疾病网络构建
根据Q-marker潜在的作用靶点的预测结果，采用Cytoscape3.7.1软件的关联功能构建“Q-marker-靶点-通路-疾病关联网络图”（图4）。
经Q-marker的体内靶点预测，得到与靶点相关的通路，选取与脑外伤、脑震荡、神经保护等疾病相关的通路的构建，得到以藁本内酯、川芎内酯、梓醇、地黄苷、丹皮酚、丹酚酸、丹参酮、斯皮诺素、芍药苷、橙皮苷、酸枣仁皂苷、木兰花碱为代表的NGQ-marker，可以作用于8个关键靶点和12条信号通路。基于“Q-marker-靶点-通路-疾病”网络构建结果发现，所得到的靶点、通路多数与脑外伤、脑震荡、神经保护等方面有关，因此进一步可以确定这12个化合物作为NG的质量控制的Q-marker。
4结语
传统中药复方的临床疗效与多个活性成分的相互作用有关，并不是某一个成分的单独作用[6]。NG为中药复方制剂，临床上用于治疗脑损伤症状，促进功能恢复。本研究通过参考大量相关文献筛选出NG的Q-marker，基于NG的临床疗效、现代药理研究及潜在的作用信号通路，分析得出藁本内酯、川芎内酯、梓醇、地黄苷、丹皮酚、丹酚酸、丹参酮、斯皮诺素、芍药苷、橙皮苷、酸枣仁皂苷、木兰花碱这12个化合物为质控的核心指标，其作用的潜在信号靶点与氧化应激、免疫应答、炎症反应等通路密切相关，也是决定NG临床疗效的关键。
参考文献（略）
来源：曹建华，刘艳之，刘海霞，卫春红，王将，秦雪梅，王旭文，李震宇.基于“五原则”的脑震宁颗粒质量标志物（Q-marker）的辨识分析[J].中草药,,50(19):-.
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